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环状RNA在椎间盘退变中的作用研究进展

2020-08-01 09:25 | 来源:未知 | 责任编辑:本站编辑

 

作者:上海交通大学医学院附属第九人民医院    石鹏志

 

腰痛(LBP)目前已成为全球范围内致残的第二大病因,给人们带来了极大的经济负担。目前LBP的具体机制尚未明确,一般认为椎间盘退变(IVDD)是导致腰痛的主要病因。椎间盘作为人体最大的无血管组织,由中央的髓核、外周的纤维环及上下软骨终板构成。研究发现,IVDD与多种因素有关:一方面,与椎间盘解剖结构及营养供应具有独特性有关;另一方面,炎性反应、髓核细胞凋亡、细胞外基质(ECM)的合成与分解代谢等多种生物过程在IVDD的发生、发展过程中扮演着重要的角色。环状RNA(circRNA)是一种非编码RNA,大量存在于自然界生物中,具有丰富性、保守性及结构稳定性等特征。2013年Hansen等首先报道circRNA含有大量的miRNA反应元件,可作为miRNA海绵,在转录后水平通过发挥竞争性内源RNA(ceRNA)的作用对靶基因进行调控。已有大量研究证实,circRNA在心血管疾病、糖尿病以及癌症等疾病的发生、发展中发挥重要作用。2018年Cheng等首次报道了circRNA作为ceRNA调控髓核细胞凋亡参与IVDD。

 

Lan等研究证实在退变椎间盘中有636个circRNA表达显著失调,提示circRNA在IVDD进展中可能发挥潜在作用。差异表达的circRNA在ECM合成及分解代谢、髓核细胞凋亡及炎性反应等过程中发挥着重要调节作用。笔者主要就circRNA的特点与功能及其所参与IVDD的发生机制做如下综述。

 

circRNA的特点与功能

 

circRNA是一种不同于线性RNA的内源性非编码RNA分子,通过反向剪接所形成共价的闭合环状结构。早在1976年,Sanger等就在植物类病毒中发现了circRNA的存在。随着生物信息学及高通量测序技术的不断成熟和发展,circRNA的研究逐渐进入了一个崭新时代。

 

circRNA的特点      目前研究发现circRNA具有丰富性、保守性及结构稳定性等特点。首先,circRNA广泛存在于人体体液及细胞中,其表达水平有时远高于其亲本基因;其次,circRNA与其他RNA具有类似结构,且在序列上是进化保守的;再次,circRNA由5′端和3′端以共价键首尾相接而形成,不具有5′端帽子结构和3′端poly(A)尾巴结构,因此不被RNA核酸外切酶所降解,这使其具有比线性RNA分子更稳定的特性。

 

circRNA的功能        基于circRNA的特性,circRNA的功能也在不断被探索和研究。研究发现,circRNA主要有miRNA海绵、调节亲本基因转录、与蛋白质相互作用及翻译等功能。circRNA按照其来源可分为外显子来源的circRNA、内含子来源的circRNA、外显子-内含子来源的circRNA和基因间来源的circRNA四类。大多数circRNA来源于外显子,主要分布在细胞质中,可以通过反应元件竞争性结合miRNA,从而发挥调节miRNA靶基因表达作用。内含子来源的circRNA主要分布在细胞核中,可以通过与特异性RNA相互作用顺式调节其亲本基因聚合酶Ⅱ的转录,从而促进其亲本基因转录。部分含有核糖体进入位点的circRNA可以通过招募核糖体启动翻译机制,进而编码蛋白质。circRNA还可以与不同的蛋白分子特异性结合,提高DNA、RNA及RNA结合蛋白之间的相互作用进而发挥其生物学功能。

 

退变髓核中circRNA表达谱

 

科研人员通过转录组测序或微阵列分析技术对退变椎间盘的髓核细胞中差异表达的circRNA进行检测和分析。Wang等通过对退变和非退变的髓核细胞微阵列分析,明确了差异circRNA的表达谱,生物信息学分析后发现在退变髓核细胞中circRNA有3724个表达上调,3570个表达下调;选择其中差异表达最显著的circRNA进行验证,并预测miRNA及相关的mRNA;结果发现差异表达的circRNA主要参与髓核细胞的活性调节、氧化应激反应等方面。Zhu等通过GEO数据库的微阵列数据集分析,发现退变髓核细胞中636个circRNA、84个miRNA及1040个mRNA表达存在差异;进一步通过PPI网络分析明确了IVDD中的关键基因Fos原癌基因(FOS)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、缺氧诱导因子1亚基α(HIF1A)及转化生长因子β1(TGFB1)。Zhang等同样对GEO数据库中的退变椎间盘的数据进行分析,结果发现退变髓核细胞586个circRNA、55个miRNA及568个mRNA表达差异;并进一步分析这些差异表达的基因功能,其中586个circRNA的功能主要集中在与circRNA亲本基因失调相关的有机物转运和定位、蛋白质及大分子的定位方面。Zou等也对GEO数据库中的退变椎间盘的数据进行分析,结果发现76个差异表达的circRNA;进一步对其靶基因进行功能富集分析,发现差异表达的circRNA主要通过集中在Wnt信号通路发挥作用。因此,通过转录组测序或微阵列分析,证实退变髓核细胞中存在多个circRNA表达差异,生物信息学分析差异表达的circRNA可以为今后探索IVDD的机制奠定良好的基础。

 

circRNA参与椎间盘退变的机制

 

circVMA21作为首个在IVDD中被验证发挥重要作用的调节因子,开启了circRNA在IVDD领域研究的大门。有学者进一步研究发现,差异表达的circRNA通过参与ECM合成及分解代谢、髓核细胞凋亡及炎性反应等方面参与IVDD。

 

circRNA与ECM合成及分解     ECM主要由蛋白多糖和Ⅱ型胶原等共同构成,在维持正常椎间盘功能方面发挥关键作用。在IVDD过程中,ECM降解酶包括金属蛋白酶3(MMP3)和聚蛋白多糖酶5(ADAMTS5)的表达增加,导致蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成减少,降解增加,从而使得ECM合成及分解代谢的动态平衡被打破,引起髓核脱水和纤维化等一系列病理过程。2018年,Cheng等研究发现退变髓核组织中miR-200c表达显著上升,通过过表达和抑制miR-200c发现,miR-200c在ECM的合成及分解代谢中发挥重要作用;生物信息学分析发现,circVMA21可能作为miR-200c上游的调节因子参与miR-200c对靶基因X连锁凋亡抑制因子(XIAP)的调控;进一步研究发现抑制circVMA21表达可以减少ECM表达,过表达circVMA21可以促进ECM表达。说明circVMA21通过作为miR-200c的ceRNA调节XIAP参与ECM的合成及分解代谢,从而在IVDD过程中发挥重要作用。随后Song等的研究同样发现,在退变椎间盘髓核细胞中,circRNA_104670表达显著上调;进一步研究发现仅干预circRNA_104670后Ⅱ型胶原表达显著增加,MMP-2表达显著减少;而对circRNA_104670和miR-17-3p同时干扰后,Ⅱ型胶原和MMP-2的表达则恰好相反。说明circRNA_104670通过作为miR-17-3p的ceRNA调节MMP-2参与ECM的代谢,从而在IVDD过程中发挥重要作用。

 

当然,调节ECM的circRNA并不仅限于circVMA21和circRNA_104670,circ-4099、circSEMA4B和circRNA-CIDN也参与其中。Wang等研究发现circ-4099-miR-616-5p-Sox9构成的ceRNA调节网络可以通过促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成,抑制其降解,从而延缓IVDD的进程。另外,circSEMA4B-miR-431-(SFRP1/GSK-3β)的ceRNA网络可以通过Wnt信号通路影响ECM的合成及分解。Xiang等研究发现,在压缩应力诱导的髓核细胞中,circRNA-CIDN可以通过特异性结合miR-34a-5p影响沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达,从而调节ECM代谢;上调circRNA-CIDN后可以明显下调参与ECM代谢的MMP-3及MMP-13表达水平。综上,circRNA主要通过作为miRNA的ceRNA调控靶基因,进而调控ECM合成及分解代谢,从而参与IVDD进程。

 

circRNA与髓核细胞凋亡      细胞死亡作为一个基本的生物学过程,主要分为细胞凋亡、自噬及坏死三类。髓核细胞凋亡作为一种程序性死亡过程在IVDD过程中发挥重要作用,Zhang等研究发现在退变椎间盘中髓核细胞凋亡增加。椎间盘中髓核细胞凋亡增加会导致髓核细胞功能受损,进而影响ECM表达。因此,抑制髓核细胞凋亡可以作为延缓IVDD的另一条重要途径。

 

研究发现,退变椎间盘来源的髓核细胞增殖速度减慢,差异表达的circRNA有7294个,其中3724个表达上调,3570表达下降。Xie等研究发现,在人退变椎间盘中,circERCC2表达下降,生物信息学分析预测miR-182-5p可能作为circERCC2的下游结合靶点发挥作用,而SIRT1则可能是miR-182-5p发挥作用的靶基因;circERCC2过表达可以明显改善线粒体功能,抑制髓核细胞凋亡,而SIRT1抑制剂可以阻止circERCC2对髓核细胞的保护作用;在氧化应激诱导的髓核细胞中抑制miR-182-5p后可通过调控靶基因SIRT1参与调节线粒体功能和抑制髓核细胞凋亡。由此说明circERCC2通过circERCC2-miR-182-5p-SIRT1网络抑制髓核细胞凋亡,调节线粒体功能,进而减缓IVDD进程。Guo等研究发现,在人退变髓核细胞中,circ-GRB10表达显著下调;通过在营养剥夺构建的髓核细胞退变模型中过表达circ-GRB10,结果发现circ-GRB10过表达可以抑制髓核细胞凋亡;后续生物信息学预测和验证分析发现circ-GRB10通过发挥miRNA海绵功能,结合miR-328-5p,从而使靶基因erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)表达增加,促进髓核细胞增殖,抑制髓核细胞凋亡。由此说明circ-GRB10通过circ-GRB10-miR-328-5p-ERBB2网络调控髓核细胞凋亡。

 

circVMA21作为IVDD过程重要的调节因子,不仅参与ECM代谢,还在髓核细胞凋亡过程中发挥重要作用。Cheng等研究发现,circVMA21过表达可以显著抑制炎症因子诱导的髓核细胞凋亡,而抑制circVMA21表达则促进髓核细胞凋亡,说明circVMA21-miR-200c-XIAP的ceRNA网络同样可以抑制髓核细胞凋亡。Song等研究发现,干扰circRNA_104670表达可以显著抑制髓核细胞凋亡,而在circRNA_104670和miR-17-3p共同干扰后,上述抑制髓核细胞凋亡的作用被减弱,说明circRNA_104670可作为miR-17-3p的ceRNA调节髓核细胞凋亡。同样,Xiang等研究发现,压缩应力可以导致髓核细胞凋亡显著增加,过表达circRNA-CIDN可以明显降低Bax及caspase-3表达,增加Bcl-2表达从而减轻髓核细胞凋亡。circRNA除直接参与髓核细胞凋亡外,还参与髓核细胞衰老的调节。Wang等实验发现,circSEMA4B过表达能显著抑制髓核细胞衰老,促进其增殖;进一步研究发现抑制circSEMA4B表达导致髓核细胞衰老增加,而使用miR-431的抑制剂可以抑制上述髓核细胞的衰老增加。因此说明circSEMA4B参与髓核细胞增殖及衰老的调节。综上,circRNA主要通过作为miRNA的ceRNA调控髓核细胞增殖、衰老及凋亡过程,从而在IVDD过程中发挥作用。

 

circRNA与炎性反应     既往研究表明,多种炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8等均参与IVDD过程。研究表明circRNA通过调控炎症因子表达参与IVDD。Wang等[30]研究发现,circ-4099在通过circ-4099-miR-616-5p-Sox9网络调控ECM的同时,也参与髓核细胞中炎症因子的调节;过表达circ-4099后髓核细胞中炎症因子的mRNA表达显著抑制,而miR-616-5p模拟物可以缓解这种抑制效果,因此说明circ-4099还可以通过调节炎症因子表达参与IVDD。虽然目前circRNA在调控炎症因子表达影响IVDD的研究较为局限,但并不表明circRNA在调控IVDD炎性反应中不重要。相反,circRNA通过调控炎性反应参与IVDD可能是今后研究的一个方向。

 

circRNA与软骨终板退变      软骨终板作为椎间盘的重要组成部分,是椎间盘营养供给的重要通道,软骨终板的退变直接影响到椎间盘的正常功能并直接加速IVDD的发生。因此,软骨终板退变对IVDD的发生发展具有重要意义。Xiao等研究发现,在张力刺激的软骨终板细胞中,存在张力敏感的circRNA_0058097;进一步研究发现,张力刺激后软骨终板细胞中circRNA_0058097表达显著增加,而抑制circRNA_0058097表达可以增强软骨终板细胞的抗压特性,进而可能延缓软骨终板退变;后续探究circRNA_0058097作用机制的实验发现,circRNA_0058097作为ceRNA特异性结合miR-365a-5p,进而调控靶基因组蛋白脱乙酰酶4(HDAC4)在软骨终板细胞中的表达。因此circRNA_0058097-miR-365a-5p-HDAC4构成的ceRNA网络参与软骨终板细胞的抗压特性,从而影响软骨终板退变,参与IVDD。

 

总结与展望

 

综上所述,circRNA作为重要的调节因子,目前主要通过circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络调控ECM合成及分解代谢、髓核细胞凋亡及炎性反应等多个途径参与IVDD。从治疗角度出发,未来我们也许可以设计某种小分子物质,作为circRNA模拟物或siRNA的载体转入退变椎间盘中,用以靶向调控失调的circRNA,从而实现生物学治疗IVDD。与此同时,笔者一直在思考几个问题:circRNA的表达究竟是受何种因素调控,是否在circRNA的上游还存在某些调控因子,将circRNA-miRNA-mRNA网络串联成一个反馈调节环路来发挥作用,这可能需要今后的研究来验证。

 

当前对IVDD中circRNA的研究仅局限在退变髓核细胞中,纤维环及软骨终板作为椎间盘的重要组成部分与IVDD的发生发展休戚相关,但目前在circRNA层面对退变纤维环及软骨终板的研究却十分匮乏,因此未来circRNA在退变椎间盘中纤维环及软骨终板的研究可能是揭示IVDD的新方向。笔者相信,今后对circRNA的深入探究将为椎间盘退变的病因学提供新理念,为椎间盘退变性疾病的治疗提供新思路及新靶点。

 

来源:中国脊柱脊髓杂志2020年第30卷第5期

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